FITC标记套装

名　　称： FITC标记套装 规　　格： 一套

FITC标记套装

保存条件：FITC -20度保存，其他常温保存。

产品说明：本套装是将FITC标记的常用试剂集合为一体而成。适合于蛋白等含有氨基物质的标记。特别是抗体的标记。

如果待标记物分子量太小（如小于5KD），可能并不适合用此套装（主要是后期纯化去除未标记上的FITC，可选用透析袋）。

标记原理：在高PH下FITC可蛋白等分子的氨基相连，形成共价健。

操作方法：

一，  标记量的计算：FITC分子量为389.4。一般为FITC：待标记物＝10：1左右。比如抗体IgG分子量一般为150－160KD。则1mg HRP可标记抗体40mg之间。

二，  计算好各步反应时间。作好开始标记的准备工作。因为标记是在PH为9.5的条件下反应，如果待标记物本身盐含量很低并且缓冲力差，如生理盐水，可等二天再准备。如果不确定，将0.2M PH9.5 CB稀释20倍，作为透析液，将待标记物装入透析袋中4℃透析过夜，透析袋适当留长约1ml体积的量以备第二天加入酶（透析袋用双蒸水清洗三次，祥细使用请见附录）。

三，  如果样品缓冲能力很小（固体可用水溶解），加入1/20体积的0.2M PH9.5 CB，混匀。

四，  准备层析柱（使用方法见附录）。

五，  在样品准备好的情况下，称量2mg左右FITC（请不要一次称量过小，称量过小时，误差会很大），加入1ml DMSO溶解。取适量溶解好的FITC，加入准备好的样品迅速混匀。避光常温反应两小时或者4℃反应过夜。

六，  加入1/20体积的1M NH4Cl，避光4℃反应两小时。

七，  过柱。请保证总溶液体积不超过总体积的1/5。比较理想的是在1/10。也就是10ml凝胶，最多过柱1ml的标记液（此步也可以改为透析。一般避光透析两天左右，到没有明显黄色出来为止）。

附透析袋使用方法：

本透析袋已预处理过，用双蒸水清洗后将水用适当吸一下。就可直接使用。透析袋上下都可以用铁夹，但如果铁夹不够用，下部可用细线或者其他的透析袋夹。

将透析袋轻轻的折上两到三折。用线或者透析袋夹封住，上面支开，加入待透析物，留一定量的空气在顶上，并小心的折一折，用铁夹夹住，轻轻的挤压，如没发现有液体流出，可放入透析液中。一般透析可用纯净水瓶去顶使用。用一次性筷子或者其他合适物穿过铁夹，将透析袋吊在透析液中，补充透析液，使透析液盖过透析袋中的液面而不要淹过铁夹下面。

分子筛柱使用方法：

取空柱，加入双蒸水冲洗三次，找一合适的地方架好，下面收集废液，将Sephadex G-25取出摇匀，轻轻的沿壁倒入柱中（用去尖移液器加入也可以），等液体流出少量时，不停的补加凝胶到一合适的体积。一般加到10ml左右。在上口留出1－2ml空间。灌完胶后，用三倍体积的双蒸水冲洗（从上面加入，下面自动流出），再用合适的缓冲液冲洗三倍体积（如生理盐水或者PBS等）。

当最后一次加缓冲液后，把柱上层弄平整。等上层溶液完全流完，就可以加入待过柱的标记液。用去尖吸头小心的中空滴加，如果一次加不完，等流出少量后再加，一直加完。待标记物完全流干后，再加入少量约3－5滴缓冲液（如生理盐水或者PBS等），流完再加，如此三次左右，接着就可以一次加入1－2ml缓冲液（如生理盐水或者PBS等）。加到一定体积后，可以看到柱中黄色会分层。收集下层溶液，加入适当的稳定剂等，定溶。备用。

用过的凝胶可以丢弃或者重复使用（如果重复使用，须用大量的缓冲液冲洗，待上层黄色完全流走。折中的方法是小心的将上层黄色胶挖掉。流下层的回收）

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